注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

蛋白质含有三种含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和 Cys。其中，Cys 是**一种含有巯基的含硫氨基酸，从甲硫氨酸转化而来，并且可与胱氨酸互相转化。Cys 参与蛋白质二硫键的形成，经常是蛋白质活性中心的组成部分，还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外，Cys 大量积聚在皮肤和粘膜表面，在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性，并且补充巯基，以维持皮肤的正常代谢，调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。

测定原理：

Cys 还原磷钨酸生成钨蓝，在 600nm 处有吸收峰；通过 600nm 吸光度，计算 Cys 含量。

自备仪器和用品：

低温离心机、可调式移液枪、酶标仪、96 孔板、85%磷酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。用前 1 天，向试剂三中加 0.5mL 蒸馏水充分溶解，再加 85% 磷酸 0.125mL，混匀后盖紧(防止水分散失)沸水浴 2h；冷却后加 2mL 蒸馏水，4℃可保存2 周。

标准品：粉剂×1 瓶，临用前加 10 mL 蒸馏水，充分溶解。1μmol/mL 标准液，4℃避光保存。 用不完的试剂 4℃可保存 3 天。

半胱氨酸提取：

1、 液体样品中半胱氨酸提取：取 0.1mL 液体样品，加试剂一 0.9mL，充分混匀，8000g 4℃离心 10min，取上清液，待测。

2、 组织中半胱氨酸提取：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10 min，取上清液待测。

3、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：试剂一体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL试剂一)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复30 次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定操作：

1.酶标仪预热 30 min，调节波长到 600 nm。

2. 空白管：取 96 孔板，加入 20μL 蒸馏水，160μL 试剂二，20μL 试剂三，混匀后室温静置15 min，于 600nm 处测定吸光值，记为 A 空白管。

3. 标准管：取 96 孔板，加入 20μL 标准液，160μL 试剂二，20μL 试剂三，混匀后室温静置15 min，于 600nm 处测定吸光值，记为 A 标准管。

4. 测定管：取 96 孔板，加入 20μL 上清液，160μL 试剂二，20μL 试剂三，混匀后室温静置15 min，于 600nm 处测定吸光值，记为 A 测定管。

注意：空白管和标准管只需要做一次。

计算公式：

1.  按液体样品的体积计算：

半胱氨酸含量(μmol/mL)=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×(V 样总÷V样)=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

2.  按质量计算：

半胱氨酸含量(μmol/g  鲜重)=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A空白管)]×(V 样总÷V 样)÷W=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

3.  按照蛋白浓度计算：

半胱氨酸含量(μmol/mg prot)= [C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]÷(V 样×Cpr)=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷Cpr

4.  按细胞数量计算：

氨基酸含量(μmol/10⁴ cell)=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)] ×(V 样总÷V 样×细胞数量)=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷细胞数量

C 标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V 标准品：反应体系中加入标准品体积，0.02mL；V 样：反应体系中加入样品提取液体积，0.02  mL；V 样总：样品提取液，1mL；W：样品质量，g。

注意事项：

最低检出限为 100μmol/L。