注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至 NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。

测定原理

亚硝酸还原酶可将 NO₂^-还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的 NO₂^-减少，即 540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂组成和配制

试剂一：液体 4ml×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 4ml蒸馏水溶解。

试剂三：液体 4ml×1瓶，4℃保存。(如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解)

试剂四：液体 10ml×1瓶，4℃避光保存。(如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解)

试剂五：液体 10ml×1瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1的比例混合。

样品处理

新鲜土样自然风干或 37度烘箱风干，过 30～50目筛。

测定操作表

计算公式

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R² = 0.996；x为标准品浓度(μmol/ml)，y为吸光值(A标准管-A空白管)。

酶活单位定义：每 g土样每天还原 1μmol NO₂^-的量为一个酶活力单位。

S-NiR(μmol/d/g土样)=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷1.5562×V标÷W÷T= 0.617×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W

T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04ml；W：样本质量，g。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.7781x+ 0.0088，R² = 0.996；x为标准品浓度(μmol/ml)，y为吸光值(A标准管-A空白管)。

酶活单位定义：每 g土样每天还原 1μmol NO₂^-的量为一个酶活力单位。

S-NiR(μmol/d/g土样)=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷0.7781×V标÷W÷T= 1.234×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W

T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04ml； W：样本质量，g。

注意事项

1.配制好的工作液 3天内使用完。

2.若吸光值超过  1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

4.标准曲线线性范围为 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

5.A空白管-(A测定管-A对照管)线性范围为 0.02-1.5。