在生命活动的代谢过程中不断产生各种自由基，而自由基的积累会使机体产生氧化损伤而引起衰老、肿瘤、中风、心肌炎和糖尿病等慢性疾病，在众多自由基中 2，2-二苯基-1-苦基苯肼( DPPH)是一种较稳定的自由基，当有自由基清除剂存在时颜色由紫色向黄色转变，吸光度随之变小。

DPPH自由基清除率检测试剂盒(微板法)又称氮自由基清除能力检测试剂盒或氮自由基清除率检测试剂盒，其检测原理是 DPPH自由基是一种较稳定的含氮自由基，含一个单电子，溶于乙醇后溶液呈紫色，在 517nm下有强吸收，如果有其他物质提供一个电子与此单电子配对，溶液会褪色，褪色程度与接受电子的量呈正比，通过吸光度下降的程度来反应样品的氮自由基清除能力，主要用于检测血清、植物组织、抗氧化类食品、保健品及药品等样本。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：

1、蒸馏水、无水乙醇

2、实验材料：植物组织(芹菜、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等

3、研钵或匀浆器或粉碎机或超声破碎机

4、离心机、离心管

5、恒温水浴锅、恒温干燥箱

6、电子天平、30～50目筛

7、酶标仪、96孔板

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①植物样品：取新鲜植物样本，清洗干净，研钵研碎(粉碎)，干燥箱烘干后过筛，称取0.05g样品，加入 0.8ml氮自由基提取液，40℃水浴浸提 30～60min，10000rpm离心10min，上清液待用，4℃保存备用(亦可参考相关资料提取方法提取)。

②血浆、血清和尿液样品：血浆(用肝素或枸橼酸钠抗凝，不宜使用 EDTA抗凝) 4℃ 5000rpm离心 10min，取上清液待用；血清或尿液样品可直接测定。

③细胞样品：按每 5×10⁶个细胞加入 0.8ml氮自由基提取液，超声破碎(功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)，10000rpm离心 10min，取上清液待用。

④果汁、葡萄酒等样品：按样品：氮自由基提取液=1：9的比例震荡混匀，10000rpm离心 10min，上清液待用，4℃保存备用。

⑤高活性样品：如果样品中有效浓度较高，可用提取液进行恰当的稀释。

2、配制维生素 C溶液：将一支 10mg维生素 C充分溶解于 1ml氮自由基提取液中，即成10mg/ml维生素 C溶液；可分成 0.1ml的小份，-20℃保存。

3、配制 Vc标准工作液：如需测线性关系，建议用氮自由基提取液将 10mg/ml维生素 C溶液稀释至 20、15、10、8、6、4、2μg/ml的 Vc标准工作液；如需清除率约为 100%的阳性对照，建议选用大于 30μg/ml的 Vc标准工作液。

4、酶标仪开机预热 30min以上，调节波长 517nm(500～530nm亦可)，无水乙醇调零。

5、DPPH加样：按照下表设置空白管、样本测定管、样本对照管、阳性对照管，溶液应按照顺序依次加入，混匀，室温避光静置 30min。

6、OD值测定：取 96孔板，将各管溶液依次吸取 300ul加至 96孔板中，用酶标仪检测各管吸光度值，依次记为 A0、A1、A2、A3。

计算：

阳性对照·DPPH清除率(%)= ( A0- A3)/A0×100%

待测样本·DPPH清除率(%)=[A0-( A1- A2)]/A0×100%

备注：

A0=空白管的吸光度值

A1=样本测定管的吸光度值

A2=样本对照管的吸光度值

A3=阳性对照管的吸光度值

注意事项：

1、正式测定之前建议选择 2～3个预期差异较大的样本做预实验。

2、实验材料应尽量新鲜，当天提取当天测定。

3、不同样本清除 DPPH自由基的能力差异很大。

4、如样本 DPPH清除率大于 90%，应用提取液稀释；如样本 DPPH清除率小于 5%，应提高样本用量以提高有效成分浓度。

5、样品中不宜添加 Triton、DTT等可能影响氧化还原反应的成分。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效；4℃运输，4℃保存。

附录：标准曲线制作：在室温条件下按说明书操作，对系列 Vc标准工作液(20、15、10、8、6、4、2、1μg/ml)进行吸光度的测定，其数值及标准曲线如下(仅供参考)：

由上图可知：Vc标准工作液在 2～8μg/ml时线性关系良好， ·DPPH清除率与 Vc浓度呈正相关，当 Vc浓度大于 10即开始有偏差，Vc浓度大于 12时， ·DPPH清除率大于 90%。