正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

海藻糖是功能性低聚糖，具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性，是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一，它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)催化麦芽糖合成海藻糖，是海藻糖生物合成的关键途径之一。

测定原理：

TS 催化麦芽糖产生海藻糖，使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖，通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量，按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合酶活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 12ml×1 瓶，4℃保存，充分混匀，如有沉淀，静置后取上层清液使用；

试剂三：液体 10ml×1 瓶，4℃避光保存；

试剂四：液体 10ml×1 瓶，4℃避光保存；

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复30 次)；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液)，冰浴中匀浆。8000g  ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、在 EP 管中加入如下试剂

混匀，40℃水浴反应 2h，95℃水浴 10 分钟终止反应，冷却至室温。

混匀，60℃过夜反应，10000g 25℃离心 10min，取上清待测。

2、工作液配制：临用前将试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合，用多少配多少。

3、在 96 孔板中加入如下试剂

混匀，室温反应 30min，于 505nm 下测定吸光值 A 对照与 A 测定，ΔA=A 对照-A 测定。

每个测定管设一个对照管。

TS 活力计算：

1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.3735x - 0.0014，R2 = 0.9999；x 为标准品浓度(μmol/mL)，y 为吸光值。

2、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 麦芽糖产生 1nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0014)÷0.3735×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000÷2=33.5×(ΔA+0.0014)÷Cpr

3、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol 麦芽糖产生 1nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS 活力(nmol/min/g  鲜重)=(ΔA+0.0014)÷0.3735×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000÷2=33.5×(ΔA+0.0014)÷W

4、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 麦芽糖产生 1nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0014)÷0.3735×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T×1000÷2=0.067×(ΔA+0.0014)

V 样：加入样本体积：0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体积，

0.3mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万； T：反应时间，120min；1000，μmol 到 nmol 转换系数；2，1 分子麦芽糖转化为 2 分子葡萄糖。