正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌类中，该酶催化肉桂酸羟化作用产生 4-香豆酸盐，是苯丙烷途径中继 L-苯丙氨酸解氨酶之后的**个关键酶。

测定原理：

C4H催化肉桂酸和 NADP生成 4-香豆酸盐和 NADPH，在 340nm下测定 NADPH生成速率，即可反映 C4H活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)取试剂二一瓶，加入 25mL试剂一充分溶解混匀，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min；现配现用(配好后 24h内用完)；

(2)在 1mL石英比色皿中加入 50μL样本和 950μL试剂二，混匀，立即记录 340nm处初始吸光值 A1和 5min后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

C4H活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。